经肝动脉灌注重组人血管内皮抑制素联合化疗栓塞治疗兔VX2肝癌

2006-03-22 00:11:55 作者：佚名来源：本站原创浏览次数：36 文字大小：【大】【中】【小】

肝动脉栓塞化疗术（TACE）已成为手术不能切除的肝细胞癌的首选疗法，但其5年生存率低于10％。研究表明[1,2]，TACE后，肿瘤缺血缺氧，启动一系列促血管生成因子如VEGF、bFGF、PDGF等的产生，促进肿瘤新生血管的形成，使肿瘤得以继续生长、复发及转移。肿瘤血管生成是限制TACE疗效的关键所在。肿瘤血管的形成依赖血管内皮细胞的激活、增殖、吸附和成熟过程，这些过程都可以成为抗血管生成治疗强大作用靶点[3,4]。因此，若TACE与抑制血管生成相结合治疗肝癌，将会为肝癌介入治疗开拓崭新的前景。本实验就是用重组人血管内皮抑制素经肝动脉注入联合TACE治疗兔VX2肝癌，通过多层螺旋CT(MSCT)灌注成像与病理来分析治疗后肿瘤生长速度、肿瘤血供及微血管生成状况，从而对其疗效进行评估；同时对MSCT灌注成像参数与血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）之间相关性进行探讨。
1.材料与方法
1.1 VX2肝癌兔模型制作：新西兰大白兔30只(南京金陵种兔场提供)，体重2.5～3.0kg，雌雄不限。荷瘤种兔原购自华中科技大学，现本实验室将瘤细胞接种于兔后肢皮下成瘤并完成稳定传代。实验兔采用1%戊巴比妥钠(3ml/kg)经耳缘静脉注射麻醉。手术方法:剑突下略偏左作约1.5cm长切口，打开腹腔，暴露肝脏，用生理盐水湿润的纱布轻柔地将肝左叶拉出体外，经16号针头注入量约0.5ml备用瘤种（约1mm3瘤组织块与生理盐水混悬液），针尖刺入深度1～1.5cm左右，拔针时立即用盐水纱布压迫约15～20s后，确认穿刺点无瘤组织溢出，将肝脏回纳入腹腔，逐层缝合切口。缝合后碘孚消毒。术后连续四天（含手术当天）大腿外侧肌注青霉素预防感染。
1.2 VX2肝癌兔介入栓塞治疗：使用GE公司Innova3100平板DSA机，动物全麻下暴露股动脉并切开，置入4F导管鞘，沿鞘选入4F单弯导管，选入腹腔干行DSA，明确肝动脉走行后3FRenagade导管（Boston Scientific Inc.）超选入肝动脉，手推注入优维（300mg/100ml）约3ml，采集帧数4/s，摄影明确肝癌的供血情况。30只兔随机分为三组，每组10只：A组：经肝动脉灌注灌注重组人血管内皮抑制素注射液0.75 mg（0.25mg/kg)（商品名恩度TM表阿霉素3mg(1mg/kg)＋碘化油混合液0.6ml；B组：经肝动脉内灌注表阿霉素3mg(1mg/kg)＋碘化油混合液0.6ml；C组为对照组，于肝动脉内灌注同等剂量生理盐水。术毕拔除导管及鞘管的同时结扎股动脉近端，缝合切口。缝合后予碘孚消毒。 EndostarTM 代号：YH-16，先声麦得津公司）＋

   1.3 MSCT扫描：使用Siemens 64层螺旋CT机，30只VX2肝癌兔于治疗前（即接种VX2肿瘤组织2周后）行CT平扫，观察肿瘤生长情况。扫描条件：管电压120kV，管电流120mA，矩阵512 x 512，扫描视野(FOV )12-16cm，层厚2.0mm。于治疗后两周进行MSCT灌注扫描。检查当日兔禁食12h以上，将其麻醉后仰卧位固定于木板上，扎腹带以减少呼吸运动，先行常规CT平扫，选取肿瘤最大层面的相邻4层为灌注层面。扫描前于兔耳缘静脉插人静脉输液针(21GA x 0.75IN)，用高压注射器以1.0 ml/s速度注入对比剂碘海醇(350mg/ml)5ml，自对比剂开始注入后延迟5s连续无间断扫描40s。扫描条件：层厚7.2 mm，电压120 kV，电流100mA。将灌注扫描所得图像传到工作站，用BODY PCT中的肝脏灌注软进行后处理，得到灌注伪彩功能图。选取肝肿瘤最大两层相邻层面，用不规则画法选定感兴趣区，然后读取BV、BF、PS灌注参数值，取两层面所得参数平均值。ROI范围尽可能大，且尽量避开肿瘤中央坏死区域及周围正常肝组织，在肿瘤边缘选取。
   1.4 病理标本制备及免疫组织化学检查：三组动物均于MSCT灌注扫描完后立即处死，切取癌灶周边非坏死区及其周围肝组织，用4%中性甲醛固定24h后石蜡包埋，尽量取与灌注扫描层面相同切面且肿瘤边缘组织切片。抗兔CD31与VEGF抗体成套染色系统均由天津灏阳生物有限公司提供，产地为cellsc-ience。由病理科专职技术员作HE染色及MVD、VEGF免疫组化染色。VEGF表达测定:肿瘤细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，在400倍光镜下取3个视野采用计数网格(统计场面积为114.3μm×114.3μm)，对网格内阳性染色的细胞进行计数，取其平均数为该病例的VEGF阳性染色细胞数。MVD记数参照Weidner等[5]的方法并加以改进：每张切片先在40倍视野下观察整张切片的血管分布情况，然后选取癌灶的5个微血管最丰富的区域，即“热点”，在200倍视野下进行计数。任何黄染的细胞或细胞簇即使未显示管状结构只要和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开均计为1个血管，取其平均值。
   1.5 统计学分析：计量资料变量分析采用ANOVA，多组的两两间比较采用LSD检验，相关性分析采用Person检验。统计学软件使用SPSS12.0软件。
2.结果
   2.1 治疗前后肿瘤体积及生长速率情况（表1）
   三组于治疗前体积差异无统计学意义（分别1572.4±881.7mm3、1613.4±489.8mm3、1643.1±1043.0 mm3，P=0.999）。治疗两周后，三组肿瘤体积均较前增大，中央均有明显坏死，但重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE组与单纯TACE组治疗后肿瘤体积及生长率明显较对照组小（分别为7407.2±3640.1 mm3、512.6±299.2％；8033.0±2526.3 mm3556.7±267.8％；19482.7±3829.5 mm3、1451.2±613.4％），差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)，而重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE组与单纯TACE组治疗后肿瘤体积及生长率组间差异无统计学意义(P>0.05)。
   2.2 治疗后三组肿瘤周边灌注参数值比较（表2）
   重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE治疗后肿瘤周边血流量（blood flow, BF）、血容量(blood volum,BV)、血管表面渗透面积（permeability surface area product,PS）值均较单纯TACE与对照组增高（BF分别为：76.89±17.93、56.78±14.3658.03±13.37ml/min/100ml，BV分别为6.63±1.56、4.80±1.44、4.98±1.25ml/100ml；PS分别为34.61±14.79、22.46±11.22、23.48±10.13 ml/min/100ml)，差异有统计学意义（P<0.05）。单纯TACE组与对照组肿瘤周边BF、BV、PS值均没有统计学差异（P>0.05）。
   2.3 治疗后肿瘤周边病理参数MVD、VEGF的变化（表2）
   免疫组织切片经CD31单克隆抗体标记后，在肿瘤组织及其邻近间质内，肿瘤血管内皮细胞胞膜或胞质内呈棕黄色着色。VEGF主要表达在细胞胞浆内，阳性细胞见胞质或胞膜出现棕黄色颗粒。重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE治疗后，肿瘤微血管稀少，且以类圆形管腔结构为主（见图4）；VEGF阳性细胞散在分布，MVD、VEGF表达值分别为16.3±10.7/200倍视野、51.6±16.2/400倍视野。而单纯TACE后及对照组见肿瘤组织及邻近间质内微血管多而密集，以单个内皮细胞或裂隙样内皮细胞簇结构为主（见图5）；VEGF阳性细胞弥漫分布于癌巢中（见图6）。单纯TACE组及对照组MVD、VEGF表达值分别为68.4±15.6个/200倍视野、143.9±47.6个/400倍视野；56.3±17.3个/200倍视野、128.2±43.1个/400倍视野。重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE治疗组MVD、VEGF表达均较单纯TACE组、对照组显著减低，差异有统计学意义（P<0.01），单纯TACE组较对照组MVD、VEGF表达虽增高，但差异没有统计学意义（P>0.05）。
   2.4 肿瘤周边灌注参数值与MVD、VEGF相关性分析(表3)重组人血管内皮抑制素灌注联合TACE治疗组BF、BV、PS分别与MVD、VEGF表达均呈线性正相关（P<0.05），而单纯TACE组及对照组中BF、BV、PS与MVD、VEGF表达无简单线性相关性(P>0.05)。三组中MVD、VEGF均呈显著正相关（P<0.01）。

表1 三组肿瘤体积及生长速率

治疗前体积（mm³）治疗后体积（mm³）生长率（％）

恩度＋TACE 1572.4±881.7 7407.2±3640.1 512.6±299.2

单纯TACE 1613.4±489.8 8033.0±2526.3 556.7±267.8

对照组 1643.1±1043.0 19482.7±3829.5 1451.2±613.4

P值 0.999 0.001 0.020

表2 治疗后三组肿瘤周边灌注参数值及MVD、VEGF表达情况

恩度＋TACE 76.89±17.93 6.63±1.56 34.61±14.79 16.3±10.7 51.6±16.2

单纯TACE 56.78±14.36 4.80±1.44 22.46±11.22 68.4±15.6 143.9±47.6

对照组 58.03±13.37 4.98±1.25 23.48±10.13 56.3±17.3 128.2±43.1

P值 0.011 0.014 0.047 0.000 0.000

表3 肿瘤周边BF、BV、PS与MVD、VEGF相关性

MVD VEGF r值 P值 r值 P值	MVD与VEGF 相关性
恩度 BF 0.660 0.038^＊ 0.651 0.041^＊＋ BV 0.703 0.023^＊ 0.752 0.012^＊ TACE PS 0.644 0.045^＊ 0.685 0.029^＊	r=0.898 P=0.000^＊＊
BF -0.246 0.494 -0.259 0.469 TACE BV -0.199 0.582 -0.325 0.359 PS -0.152 0.676 -0.238 0.508	r=0.826 P=0.003^＊＊
BF -0.095 0.794 0.105 0.773 对照组 BV -0.174 0.630 -0.197 0.585 PS -0.168 0.644 0.141 0.699	r=0.873 p=0.001^＊＊＊P <0.05，＊＊ P<0.01；

   3.讨论
   许多研究表明[6-8]，TAE或TACE后，残活肿瘤细胞增殖、侵袭能力增强，促血管生成因子VEGF等表达上调，促进肿瘤新生血管形成。在本实验中，于TACE后2周，肝癌大小较对照组减小，但残存周边肿瘤组织VEGF表达及MVD与对照组相比，反而有所增高，虽然这种差异没有统计意义。这说明，虽然TACE后，肿瘤有效血供减少及肿瘤细胞坏死，肝癌短期生长速度有所抑制，但是，残存肝癌细胞具有潜在的更强侵袭、转移活性。
   TAE或TACE后肿瘤新生血管的形成使得肿瘤得以复发、转移，是限制TACE远期疗效关键所在。因此，抗血管生成在TACE或TAE治疗中，将发挥不可替代的作用。抗血管生成有多个作用靶点，多个作用靶因子，VEGF为常见、重要的一个作用靶因子。Wu等[9]用ODNs（VEGF反义寡脱氧核肽）联合TAE治疗大鼠Walker-256肝移植癌后，肝癌生长率、MVD较对照组与单纯TAE组明显减低，VEGF mRNA表达最低。本实验中重组人血管内皮抑制素以血管内皮细胞为作用靶点，能下调体内的促血管生成因子，上调体内的血管生成抑制因子，通过改变血管生成调节因子的平衡关系，发挥抗血管生成作用。实验得出，恩度联合TACE治疗肝癌2周后，肝癌生长率较对照组明显减低，且VEGF表达及MVD较单纯TACE与对照组明显减低。重组人血管内皮抑制素能显著地发挥抗血管生成效应，抑制了TACE后肿瘤复发、转移的潜在性。
   对于反映肿瘤血管生成的评价指标，MVD是传统定量评价的金标准。随着MSCT灌注成像的发展与广泛应用，CT灌注参数能否替代有创的MVD、准确地监测肿瘤血管生成，目前仍没有明确的定论。Kan等[10]用抗血管生成剂SU5416治疗大鼠肝癌后，得出治疗组的BF、BV、PS较对照组明显增高，而MVD却显著降低；且在SU5416治疗组，MVD与血管腔的周长与面积显著相关。Kan认为，CT灌注参数能量化成熟的有功能血管的血流灌注状态，但不能量化在抗血管生成治疗中的MVD变化。Jain[11]与Tong[12]等亦提出抗血管生成治疗后，肿瘤MVD的变化与血流灌注相反的观点。
    本实验中，三组间的灌注参数变化与病理参数MVD、VEGF的变化并不一致。重组人血管内皮抑制素联合TACE治疗后，肿瘤周边MVD、VEGF表达减低，而BF、BV、PS较单纯TACE与对照组均明显增高。分析原因可能为：一方面，CT灌注参数值反映的是有血流的血管灌注情况，血管化程度的不同会导致成熟有功能的血管数量的明显差异，从而导致CT灌注量的不同；另一方面，大量新生血管的形成，使得肿瘤间质压力增高，反而限制了血管的血流灌注量。本实验中免疫组化显示，单纯TACE组及对照组中，新生血管结构以单个内皮细胞、内皮细胞簇形成为主，而有完整管腔结构的血管较少；大量新生内皮细胞、细胞簇及血管芽使得肿瘤间质压力显著增高，反而使残存的功能血管的血流灌注明显减低，BF、BV减低。用重组人血管内皮抑制素灌注治疗后，能直接作用于血管内皮细胞，抑制内皮细胞的增殖、迁移，阻断了新生血管的形成的起点。新生血管形成的抑制，极大降低了肿瘤间质压力，使TACE后残存的有功能的微血管血流灌注得以增高，BF、BV增高。
此外，在重组人血管内皮抑制素联合TACE治疗组中，灌注参数与MVD、VEGF呈正相关，而单纯TACE与对照组中，BF、BV、PS 与MVD、VEGF并没有简单线性相关性。其原因可能为：CT灌注成像能监测到的对象是有功能的血管，而MVD是对所有各种血管化程度不同的新生血管的总的计数，包括无功能的单个内皮细胞、内皮细胞簇、血管芽等，这可能是实验中单纯TACE组与对照组的CT灌注参数与MVD没有简单线性相关性的原因。而在重组人血管内皮抑制素联合TACE组后，新生血管形成的抑制，使肿瘤微血管主要以残存的有血流灌注的血管为主，灌注成像能监测的血管与MVD计数的血管趋于一致，从而使得CT灌注参数能反映这些血管的血流灌注状态。
    对于PS，它反映的是造影剂从血管内向肿瘤组织间隙的扩散特性，其测量值与许多因素有关：1）小分子造影剂的应用，使得其量化值增高。2）CT监测到血管的PS值不能真实反映所有新生血管的内皮细胞基底膜的状态，与新生血管的血管化程度密切相关。3）在有血流的管腔中，应用小分子造影剂测得PS值受BF的影响，高的BF会产生高的PS[13、14]。以上原因均使得PS值在重组人血管内皮抑制素联合治疗组有高估，在对照组与TACE组却低估。
    总之，重组人血管内皮抑制素能抑制TACE后新生血管的生成，降低了TACE后肿瘤复发、转移的可能性，TACE联合重组人血管内皮抑制素开创了肝癌治疗的新前景。目前，对于抗血管生成治疗后，CT灌注参数的变化及其与病理参数相关性的研究资料较少，而且本实验中，亦存在一些缺点，如实验样本量偏少，观察时间短，观察点少，尤其是在获取CT灌注参数及MVD、VEGF测定方法的局限性都会不可避免的影响实验结果的精确性。因而，此方面仍需进一步的研究。
                                                                            （作者：东南大学临床医学院）

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本文引用地址： http://www.131.org.cn/article/2006/0322/7644.html

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